PATH logo   Predictieve Analyse voor THerapie

smMIP Technologie

smMIP staat voor single molecule Molecular Inversion Probe. Een smMIP bestaat uit twee probes (extensie en ligatie), die complementair zijn aan sequenties op dezelfde DNA-strand. De tussenliggende sequentie is de regio van interesse (Figuur 1). Naast deze specifieke probes, bevatten alle smMIPs dezelfde backbone sequentie waar algemene primers voor amplificatie kunnen binden. Direct naast de ligatie probe is een sequentie van 8 random nucleotiden ingebouwd, die de 'moleculaire barcode' ofwel 'single molecule-tag' vormt. 

Figuur 1: Schematisch overzicht van een smMIP
 

De smMIP reactie bestaat uit drie afzonderlijke stappen, zoals weergeven in Figuur 2. Tijdens de capture reactie (Figure 2A) hybridiseren de smMIPs aan genomisch DNA. Het ‘onstaande gat’ in de smMIP wordt opgevuld met behulp van DNA polymerase en ligase: er ontstaat een circulaire smMIP. Om alle overgebleven lineaire DNA fragmenten op te ruimen vindt er een exo-nuclease behandeling plaats (Figuur 2B). Alleen de single-stranded circulaire smMIPs blijven over. Deze worden geamplificeerd met behulp van PCR  en primers die sequenties in de backbone van de smMIP (groen) herkennen (Figure 2C). Bovendien bevatten deze primers een ‘sample-indexing’ barcode, welke gebruikt kan worden voor sample-multiplex next-generation sequence analyse.

Figuur 2: Schematisch overzicht van een smMIP reactie
 

De smMIP library PCR moleculen bevatten de probe sequenties (zwart), de moleculair barcode van de smMIP en de target sequentie (1). Met behulp van de probe sequentie worden de sequentie reads gealigned (2). Sequentie reads die dezelfde moleculaire barcode bevatten (en dus afkomstig zijn van dezelfde capture) worden samengevoegd in één consensus read sequentie (3). Voordeel van deze consensus is dat sequence varianten die het gevolg zijn van PCR en sequencing artefacts verloren gaan. Alleen echte mutaties blijven op deze manier behouden (Figuur 3).

Figuur 3: Schematisch overzicht van consensus read building

 

Bron: